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CRISPR-Kopien: Neues Werkzeug beschleunigt und optimiert Genom-Editierung

CRISPR/Cas-Systeme haben im letzten Jahrzehnt enorme Fortschritte gemacht. Diese präzisen Genom-Editierwerkzeuge finden Anwendung in der Entwicklung transgener Pflanzen bis hin zur Gentherapie und darüber hinaus. Und mit ihrer jüngsten Entwicklung von CRISPR-COPIES verbessern die Forscher des Center for Advanced Bioenergy and Bioproducts Innovation (CABBI) die Vielseitigkeit und Benutzerfreundlichkeit von CRISPR weiter.

Credits: Aashutosh Boob et al.

„CRISPR-COPIES ist ein Werkzeug, mit dem schnell geeignete chromosomale Integrationsstellen für die Gentechnik in jedem Organismus identifiziert werden können“, sagte Huimin Zhao, CABBI Conversion Theme Leader und Steven L. Miller Chair of Chemical and Biomolecular Engineering (ChBE) an der University of Illinois. „Es wird unsere Arbeit im Bereich des Metabolic Engineering von Nicht-Modellhefen für die kostengünstige Produktion von Chemikalien und Biokraftstoffen beschleunigen.“

Die Genbearbeitung hat die Möglichkeiten der Wissenschaftler zum Verständnis und zur Manipulation genetischer Informationen revolutioniert. Diese Form der Gentechnik ermöglicht es den Forschern, neue Eigenschaften in einen Organismus einzubringen, z. B. Resistenz gegen Schädlinge oder die Fähigkeit, einen wertvollen biochemischen Stoff zu produzieren.

Mit CRISPR/Cas-Systemen können Forscher präzise, gezielte genetische Veränderungen vornehmen. Ein kritisches und weitgehend ungelöstes Problem ist jedoch das Auffinden der optimalen Integrationsstellen im Genom für diese Eingriffe. In der Vergangenheit mussten Forscher, wenn sie herausfinden wollten, wo sie ihre Eingriffe vornehmen wollten, in der Regel manuell nach potenziellen Integrationsstellen suchen und diese dann durch die Integration eines Reportergens testen, um die zelluläre Fitness und die Genexpression zu bewerten. Das ist ein zeit- und ressourcenintensiver Prozess.

Um diese Herausforderung zu bewältigen, entwickelte das CABBI-Team CRISPR-COPIES, eine COmputational Pipelinefor the Identificationof CRISPR/Cas-facilitated intEgration Sites. Dieses Tool kann genomweite neutrale Integrationsstellen für die meisten bakteriellen und pilzlichen Genome innerhalb von zwei bis drei Minuten identifizieren.

„Die manuelle Suche nach der Integrationsstelle im Genom ist wie die Suche nach einer Nadel im Heuhaufen“, sagte Aashutosh Boob, Doktorand an der Universität von Illinois und Hauptautor der Studie. „Mit CRISPR-COPIES verwandeln wir jedoch den Heuhaufen in einen durchsuchbaren Raum, der es den Forschern ermöglicht, alle Nadeln, die ihren spezifischen Kriterien entsprechen, effizient zu finden.“

In ihrer in der Zeitschrift Nucleic Acids Research veröffentlichten Arbeit zeigten die Forscher die Vielseitigkeit und Skalierbarkeit von CRISPR-COPIES, indem sie Integrationsstellen in drei verschiedenen Arten charakterisierten: Cupriavidus necator, Saccharomyces cerevisiae und HEK 293T-Zellen. Sie nutzten die mit CRISPR-COPIES gefundenen Integrationsstellen, um Zellen mit erhöhter Produktion von 5-Aminolävulinsäure zu erzeugen, einer wertvollen Biochemikalie, die in der Landwirtschaft und der Lebensmittelindustrie Anwendung findet.

Darüber hinaus hat das Team eine benutzerfreundliche Webschnittstelle für CRISPR-COPIES entwickelt. Diese unglaublich leicht zugängliche Anwendung kann von Forschern auch ohne umfangreiche Bioinformatikkenntnisse genutzt werden.

Ein Hauptziel von CABBI ist die Entwicklung von Hefen, die keine Modellhefen sind, um Chemikalien und Kraftstoffe aus pflanzlicher Biomasse herzustellen. Die wirtschaftliche Herstellung von Biokraftstoffen und Bioprodukten aus kostengünstigen Rohstoffen in großem Maßstab stellt jedoch eine Herausforderung dar, da es an genetischen Werkzeugen mangelt und herkömmliche Genom-Editing-Methoden umständlich sind. CRISPR-COPIES ermöglicht es den Forschern, genomische Loci für die gezielte Genintegration schnell zu lokalisieren, und bietet damit eine rationalisierte Pipeline, die die Identifizierung stabiler Integrationsstellen im gesamten Genom erleichtert. Außerdem entfällt die manuelle Arbeit, die mit der Entwicklung von Komponenten für die CRISPR/Cas-vermittelte DNA-Integration verbunden ist.

Bei der Pflanzenzüchtung kann das Werkzeug eingesetzt werden, um die Biomasseerträge, die Schädlingsresistenz und/oder die Umweltverträglichkeit zu erhöhen. Bei der Umwandlung von Biomasse in wertvolle Chemikalien – zum Beispiel mit Hilfe der Hefe S. cerevisiae – können mit CRISPR-COPIES Zellen mit deutlich höheren Erträgen erzeugt werden.

Diese vielseitige Software wurde entwickelt, um den Prozess der Stammkonstruktion zu vereinfachen und zu beschleunigen und den Forschern Zeit und Ressourcen zu sparen. Forscher auf der ganzen Welt, sowohl im akademischen Bereich als auch in der Industrie, können von ihrem Nutzen bei der Stammkonstruktion für die biochemische Produktion und die Entwicklung transgener Pflanzen profitieren.

Zu den Co-Autoren dieser Studie gehören der ChBE-Doktorand Zhixin Zhu, der ChBE-Gaststudent Pattarawan Intasian und der Bioengineering-Doktorand Guanhua Xun; die Software-Entwickler Manan Jain und Vassily Petrov vom Carl R. Woese Institute for Genomic Biology (IGB); Stephan Lane, IGB Biofoundry Manager, und Shih-I Tan, CABBI Postdoc.

ZEITSCHRIFT

Nukleinsäureforschung

DOI

METHODE DER FORSCHUNG

Experimentelle Studie

GEGENSTAND DER FORSCHUNG

Nicht anwendbar

TITEL DES ARTIKELS

CRISPR-COPIES: Eine In-silico-Plattform zur Entdeckung neutraler Integrationsstellen für die CRISPR/Cas-gestützte Genintegration

ARTIKEL ERSCHEINUNGSDATUM

13-Feb-2024

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